On-site plantpathogeen detectie en barcode sequencing voor verbetering plantgezondheid en fytosanitaire controle

Beschrijving

Door de groei van handelsstromen in land- en tuinbouwproducten, het toenemende aantal reizigers en klimaatverandering neemt het risico toe dat we steeds meer ongewenste organismen verspreiden. Controle op de aanwezigheid van die ongewenste organismen is daarom gewenst en voor een handelsland als Nederland erg belangrijk. Daardoor neemt de vraag naar snelle, efficiënte en accurate on-site detectie methoden voor ziekten en plagen ten behoeve van de ontwikkeling van weerbare gewassen en duurzame teeltmethoden toe. De tot nu toe ontwikkelde on-site testen voor plantpathogenen zijn allemaal enkelvoudig in gebruik; ze zijn geschikt voor het testen van één enkele ziekteverwekker. Er is een duidelijke vraag naar meer testen ineen en het ophelderen van vragen met betrekking tot symptomen, waarvan men de oorzaak niet één, twee drie weet. Het doel is de bestaande methode voor extractie van DNA/RNA te vereenvoudigen en tegelijkertijd de efficiëntie te verbeteren zodat de methode ook on-site kan worden gebruikt. De huidige on-site toetsen zijn gericht op detectie van enkelvoudige targets. Ziekteverwekkers in de plant of in andere substraten zijn echter vaak moeilijk of niet herkenbaar, daarom is ontwikkeling van breed werkende on-site detectie technologie (multi-plexing) gewenst waardoor het voor de eindgebruiker niet nodig is om een specifieke test te selecteren.

In dit onderzoek wordt een innovatief DNA/RNA extractie protocol ontwikkeld op basis van een cellulose dipstick methode die geen gespecialiseerde apparatuur zoals hit-te blokken en pipetten vereist en die snel opzuivering van RNA en DNA uit een breed scala van geselecteerde substraten mogelijk maakt. Daarnaast wordt een innovatieve on-site multiplex methode ontwikkeld waarbij één monster wordt gemengd met meerdere LAMP primer combinaties door middel van combinatorial mixing. Dit kan worden uitgevoerd voor meerdere testmonsters tegelijkertijd. Het systeem is flexibel omdat de lege disk tijdens de uitvoering met primers naar keuze kan worden gecombineerd. Op substraten of planten met geen of onduidelijke symptomen, wordt een barcode preamplificatie en on-site Oxford Nanopore sequencing toegepast waardoor binnen twee uur de DNA sequentie van unieke regio’s van het genoom van de aanwezige plantpathogenen en virussen kunnen worden geïdentificeerd.

De impact voor de sector is een significante verbreding van de beschikbaarheid van eenvoudige detectietechnologie voor precieze on-site identificatie en vroegtijdige waarneming van (bekende en beschreven) ziekteverwekkers van planten op soortniveau in de keten.

Resultaten

Het toenemende internationale transport van plantaardige producten en klimaatverandering zorgen voor problemen voor de Nederlandse tuinbouwsector door de verspreiding van ziekteverwekkers. De ontwikkeling van snelle, nauwkeurige en gevoelige methoden voor identificatie en detectie van (plant)pathogenen die direct in de productieketen on-site kunnen worden toegepast, is essentieel. In het PPS-project On site en Barcoding is daar onderzoek naar gedaan. Het project is inmiddels afgerond.

Vroege detectie maakt tijdige actie mogelijk om verspreiding van de ziekte of vertraging en beperkingen in de export van plantgoed en zaden te voorkomen. Voor een groot aantal plantpathogenen zijn in het verleden veel detectiemethoden ontwikkeld. De uitdaging in dit voorstel was niet alleen het testen op locatie (on-site) voor deze organismen, maar ook het testen op meerdere organismen in één reactie. Ook is on-site sequencing van diagnostische monsters niet eerder getest in de tuinbouw, maar veelbelovend.

Werkpakketten

In dit project zijn de diverse activiteiten uitgevoerd in drie werkpakketten (WP1, WP2 en WP3). Bij moleculaire detectie in de productieketen spelen een aantal verschillende aspecten een belangrijke rol. Dit zijn: extractie van DNA en/of RNA, detectiemethode, analyse en gegevensinterpretatie. Voor een goede detectie moet met al deze aspecten rekening worden gehouden.

• WP1: DNA/RNA-extractie. Uit verschillende geselecteerde substraten (zoals blad, stengel, water, lucht etc.) wordt op eenvoudige wijze DNA en RNA geëxtraheerd. Er zijn verschillende extractiebuffers uitgetest om zo snel en goedkoop mogelijk goed DNA of RNA uit het plantmateriaal te verkrijgen.
• WP2: Ontwikkeling van een on-site multiplexmethode. Met behulp van eerder ontwikkelde LAMP-testen of die beschreven zijn in de literatuur. Deze zullen worden aangevuld met nieuw ontwikkelde testen.
• WP3: On-site en barcodesequencing met behulp van de MinION (ONT). Amplicons worden gegenereerd uit geselecteerde barcode gebieden door middel van PCR amplificatie en vervolgens voorbereid voor sequencing in een MinION-systeem. Data-analyse laat dan zien welke pathogenen in het monster aanwezig zijn.